Bei der zweiten Aufbereitungsstufe werden die lösliche organische Substanz, Nährstoffe wie Stickstoff und Phosphor und die meisten der suspendierten Feststoffe entfernt, die bei der ersten Aufbereitungsstufe nicht erfasst wurden. Oft werden biologische Prozesse eingesetzt, in denen Mikroorganismen organische Verbindungen und Nährstoffe metabolisieren, um selbst zu wachsen und sich zu vermehren. Die beiden am häufigsten verwendeten biologischen sekundären Behandlungsprozesse sind suspendiertes Wachstum und Wachstum auf Trägermaterial. Ein suspendierter Wachstumsprozess fördert das Wachstum von suspendierten Mikroorganismenflocken aus einzelnen Organismen, die bereits im Abwasser und im Rücklauf-Belebtschlamm vorhanden sind. Die Flocken enthalten Organismen, die die Schadstoffe in aeroben, anoxischen und anaeroben Umgebungen entfernen können. Nach der Entfernung der Schadstoffe wird das Wasser-Flockengemisch einem Nachklärungsprozess zugeführt, wo die Flocken sich über die Schwerkraft vom Wasser trennen. Ein Teil des Schlamms am Boden des sekundären Absetzbeckens wird dann wieder zurückgepumpt, um sich mit dem Primärabwasser (Rücklaufschlamm) zu vermischen. Der Rest des Schlamms wird aus dem Prozess entfernt (Überschussschlamm), um ideale Bedingungen für die Mikroorganismen zu schaffen. Wachstumssysteme auf Trägermaterial setzen auf Mikroorganismen, die sich an ein Medium binden und einen Biofilm bilden. Das Abwasser wird über die biofilmbeschichteten Medien geleitet, wobei die Mikroorganismen die Schadstoffe entfernen. Wie beim suspendierten Wachstumsprozess werden Biofilmfragmente und suspendierte Flocken zur Trennung in ein Nachklärbecken geleitet, wo Schlamm recycelt und verbraucht wird und sauberes Wasser in den nächsten Prozess eingeleitet wird.
Damit die biologische Behandlung effizient funktioniert, benötigen Organismen Nährstoffe in einem ausgewogenen Verhältnis, einschließlich Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor (bezeichnet als C:N:P), sowie Spurenelemente wie Eisen, Kupfer, Zink, Nickel, Mangan, Kalium, Schwefel und andere Komponenten, die typischerweise im Abwasser vorhanden sind. Das allgemein akzeptierte C:N:P-Verhältnis beträgt 100:5:1, obwohl einige Anlagen außerhalb dieses Verhältnisses Erfolg haben. Es kann dann aber zu Polysaccharidschleimbildung oder filamentösem Bakterienwachstum kommen, welche die Biologie hemmen und sich im Nachklärbecken ansiedeln.
Mehrere biologische Prozesse können zur vollständigen Nachbehandlung eingesetzt werden, einschließlich Pfropfenströmungsbelebungsbecken, volldurchmischte Belebungsbecken, kaskadierte Becken, Oxidationsgraben, Tropfkörper und andere.
Bei anderen biologischen Nährstoffentfernungsverfahren werden bewusst die Rahmenbedingungen modifiziert, um Stickstoff und Phosphor aus dem Wasser zu entfernen. So unterscheidet man zwischen anaeroben (kein Sauerstoff oder Nitrat), anoxischen (kein Sauerstoff, Nitrat ist vorhanden) und aeroben (Sauerstoff vorhanden) Stufen, in denen das Wasser gezielt durch solche Bereiche fließt, um verschiedene Veränderungen hervorzurufen.
Es können auch chemische Behandlungsverfahren eingesetzt werden wie z.B. die chemische Phosphatelimination. Durch Zugabe von Fällmittel wird Phosphor durch Flockung entfernt und bildet unlösliche Verbindungen, die sich absetzen und als Schlamm entfernt werden können.